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一、細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后，在37C水浴鍋內不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10m預熱的DMEM培養基，輕輕吹

勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。

加入10mIDMEM培養基清洗，棄上清液。加入10mIDMEM培養基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細胞培養箱中培養。

二、細胞傳代

細胞密度達到80%~90%時，去培養基，10mIPBS清洗2次。加入3mI含0.25%EDTA，放人細胞培養箱3min。加人1mIDMEM

培養基終止消化，轉移至15ml離心管。

加入10mIPBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10mIPBS(經高壓滅菌，保存于40C)，吹

勻，吸取10微升進行計數，按照1×106/盤接種，在含5%CO2的細胞培養箱繼續培養。

三、細胞凍存

細胞密度達到80%~90%時，去培養基，10mIPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA，放人細胞培養箱3min。加入ImIDMEM

培養基終止消化，轉移至15ml離心管。加入10mIPBS清洗細胞培養盤，轉移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。

加入Iml凍存液(90%血清，10%DMSO)，放入凍存盒內（盒內有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80C冰箱內，過夜，

第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。

凍存液的配制：70%的培養基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。

進入細胞間開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒并檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶

液。

②確定衣服的袖口已經卷起或者白大褂的袖口已經扎緊。

進入細胞間開始細胞培養時，必須嚴格按照下列步驟操作：

①確定所有的細胞操作用的溶液和耗材都已經消毒并檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶

液。

②確定衣服的袖口已經卷起或者白大褂的袖口已經扎緊。

③確定酒精燈內的酒精量，需要的話及時進行補充。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始可以把所有瓶蓋旋松。

③盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細清潔瓶口周圍（不要接

觸到瓶口）后在火焰上簡單燒灼。

操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。

實驗完畢及時收拾，保持工作區域清潔整齊，后用75%酒精清潔臺面。